Thermo Scientific Pierce RNA 3'-末端脱硫生物素化试剂盒含有用于对 RNA 进行简单且高效的脱硫生物素标记以用作探针或用于富集 RNA 结合蛋白的抗体替代物的试剂。
RNA 3'-末端脱硫生物素化试剂盒的特点：
•无放射性–单生物素标记与放射性具有相似的检测灵敏度
•易于使用–包括 RNA 连接酶和优化反应缓冲液
•经济–成本远远低于采购合成生物素化 RNA 探针的价格
•末端标记–对 RNA 二级结构的影响极小
•灵活–脱硫生物素标记既可用于检测，也可用作链霉素亲和素树脂的亲和柄
Pierce RNA 3'-末端脱硫生物素化试剂盒经过优化，可用于使用 T4 RNA 连接酶标记单链 RNA 的 3'-末端。标记后，RNA 可作为探针或靶标用于凝胶迁移 EMSA 反应、Northern 印迹以及蛋白-RNA 相互作用实验。脱硫生物素化 RNA 也可用于使用链霉亲和素亲和树脂富集 RNA 结合蛋白 (RBP)，这是因为脱硫生物素标签以特殊方式与链霉素亲和素结合，这种结合方式使得核糖核蛋白复合物能够温和洗脱。本标记试剂盒也可以作为一个组成部分包括在 Thermo Scientific Pierce 磁性 RNA-蛋白沉降试剂盒中。
包括：
脱硫生物素化胞苷二磷酸、T4 RNA 连接酶和缓冲液、未标记的 RNA 寡核苷酸（用作阳性对照品）、生物素化 RNA 探针标准品、RNase 抑制剂、糖原以及连接反应增效剂
应用：
• Northern 印迹
• EMSA
• 富集 RNA 结合蛋白 (RBP)
本 RNA 标记试剂盒使用 T4 RNA 连接酶将单个脱硫生物素化胞苷二磷酸连接至单链 RNA 的 3'-末端。按原定设计，每一次反应可标记 50 pmol RNA；然而，您也可以按需扩大反应规模（经验证，从 1 pmol 到 1 nmol 均可）。反应可使用 20 倍过量脱硫生物素化核苷酸，需要的孵育时间从 37°C 下 30 分钟（针对结构不太复杂的 RNA）到 4 到 16°C 下孵育过夜（针对序列较长或结构较为复杂的 RNA）不等。对于结构较为复杂的 RNA，可通过改变 RNA:核苷酸比例、延长孵育时间或者添加 DMSO 以解开 RNA 结构的方法来优化标记效率。有机提取和乙醇沉淀后，脱硫生物素标记的 RNA 即可用于下游应用。
采用不同 RNA 分子进行的示例实验显示了连接反应的稳健性。合成 RNA 和体外转录 RNA 皆已评估，连接效率采用合成生物素化 RNA 作为 100% 标记对照品通过半定量斑点印迹进行测定（表）。连接效率均超过 50%，其中很多超过 70%。该试剂盒对照 RNA 的连接效率超过 90%，可作为整体反应条件和试剂的指示剂。对于具有显著二级结构的 RNA 需要进一步优化，对于连接后体外转录 RNA 需要重折叠。
沉降检测中涉及 let-7 miRNA:Lin28 相互作用，显示了脱硫生物素化标记 RNA 的实验功能。经发育调控的 Lin28 蛋白是 let-7 miRNA 加工过程的选择性抑制剂，通过与 let-7 pre-miRNA 的环状区域结合产生抑制作用。为检测这一相互作用，使用脱硫生物素化胞苷标记 let-7 miRNA 环状区域的末端，然后连接到链霉素亲和素磁珠上。磁珠随后放在蛋白-RNA 结合缓冲液中与胚胎癌细胞裂解物 (NCCIT) 一起孵育。采用 Western 印迹法洗脱和检测样品。结果表明，标记的 let-7 miRNA 可以专门富集 NCCIT 裂解物中的 Lin28 蛋白，而无关 RNA 无此功能。
本试剂盒也包括在 Pierce 磁性 RNA-蛋白沉降试剂盒中，可联合使用标记试剂盒和经优化的结合、洗涤和洗脱缓冲液，以富集 RNA 结合蛋白。
