本公司承诺所有上传的商品没有国家限制经营或者需要特殊经营资质的商品，包括但不限于危化品、易制毒品、易制爆品、医疗器械、烟草、药品、毒品和其他违禁品。
货号：M082-01A
计量单位：34
包装规格：10T/盒
产品/服务描述：
产品描述
- 牛痘病毒加帽体系利用牛痘病毒加帽酶及相关组分，将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到 RNA 的 5´ 末端。在真核生物中，该结构与mRNA的稳定、转运和翻译密切相关。使用酶促反应为RNA加帽是一种简单有效的方法，且帽结构与天然Cap 0结构完全一致，能显著改善用于体外转录、转染和显微注射的RNA的稳定性和翻译能力。该酶由两个亚基（D1和D12）组成，兼具RNA三磷酸酶、鸟苷转移酶和鸟嘌呤甲基转移酶的功能，它们对于添加一个完整的Cap 0结构m7Gppp5´N都是必须的（图1）。
- 由牛痘病毒加帽酶构建的带帽RNA产品具有“cap 0”结构。通过在加帽反应中同时使用mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶和牛痘病毒加帽酶，Cap 0-RNA可以转化为“ cap 1”结构。 mRNA Cap 2'-O-甲基转移酶通过将甲基从供体分子SAM转移到cap 0- RNA 5’端紧邻帽结构的第一个核苷酸的2'-O位置，从而从Cap 0-RNA制备Cap 1-RNA。
- 本体系可用于IVT RNA的加帽反应，使加帽反应在1h之内完成，效率接近100%，并且保证正确的方向。
-
产品用途
- 体内或体外翻译前mRNA的加帽和mRNA的5’末端标记。
- 提高RNA的翻译效率；
- 改善mRNA在显微注射和转染后的表达。
保存条件
质量控制
无大肠杆菌DNA残留、无核酸内、外切酶残留及RNA酶残留。
注意事项
- SAM： SAM在pH 7-8，37°C条件下不稳定，为避免SAM降解，该工作液需要保存于冰上。
- RNA：在加帽体系使用之前，应将体外转录反应产生的RNA进行纯化并溶解于RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA溶液或其他盐溶液中。
- RNA二级结构：一些RNA转录本可能形成稳定的二级结构（同源二聚体和发卡结构），如二级结构发生在转录本的5'端会影响加帽效率。在与加帽酶反应之前加热RNA可以去除转录产物5´端的二级结构，如果转录产物的5´端结构复杂，可以把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min。
- Cap 0-和Cap 1-mRNA：Cap 0-和Cap 1-mRNA之间的差异在RNA 5'端紧邻帽结构的第一位核苷酸（N1）是否具有2'-O-甲基。在高等真核细胞中，该甲基化是天然加帽过程的一部分，Cap 1结构提高了mRNA的翻译效率。
- Poly(A) 尾：如果加帽的RNA需要添加3'-poly(A)尾巴，可以使用近岸蛋白质E. coli Poly(A) Polymerase（货号：M012）进行加尾。加帽和加尾后的RNA需在进行RNA转染实验前做纯化处理。
- RNase Inhibitor：在配置反应体系时，可以加入0.5 µl近岸蛋白质RNase 抑制剂（货号：E125），同时去掉等体积的RNase-free水。
疑难解答
- 1. 加帽效率低有哪些原因及解决方法？
- 1) 在加帽反应之前，应将IVT产生的RNA纯化去除残留蛋白质，污染物和未结合核苷酸，并溶解在RNase-free水中，不能将RNA溶解在EDTA或其他盐溶液中；
- 2) SAM在室温下会慢慢降解，需始终放置在冰上，由于SAM的降解导致的N7甲基化效率低，会进一步导致加帽失败；
- 3) 可以适当增加RNA热变性的条件，把加热时间延长至10min，加帽反应时间可延长至60min；
- 4) 某些RNA会在5'末端形成稳定结构（如同源二聚体，发卡结构），限制加帽酶靠近。分析序列后可以将RNA变性温度增加。如5'末端高度结构化，需要通过分子生物学技术来修改序列。通常可以通过在转录RNA（非编码区）的DNA模板前5个碱基中进行单点突变来实现。
- 2. 缓冲液出现白色沉淀如何解决？
- 1) 将反应缓冲液在37℃孵育5min，彻底混匀以溶解沉淀物；
- 2) 不要将试剂盒储存于-70℃。
