产品规格
货号：KTSM1308
规格：500 μL（50% anti-Flag tag nanobody conjugated agarose beads）
储存条件：4℃（避免冻存）
保质期：12 个月
运输：冰袋运输
产品说明
Anti-Flag Nanobody Agarose Beads （ 以 下 称 anti-Flag beads ） 是 将 抗 Flag 标 签
（DYKDDDDK）纳米抗体共价偶联到琼脂糖珠上，用于抓取哺乳动物、植物、细菌、酵母、
昆虫等多种生物的细胞提取物中的含 Flag标签的蛋白及与其紧密相互作用的蛋白。
产品应用
应用于：免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(CoIP)、染色质免疫沉淀(CHIP)、RNA 结合蛋白免疫
沉淀(RIP)、酶活性检测、质谱分析（MS）等。
产品属性
珠子直径：45-165 μm（4%交联琼脂糖珠）
储存液：1xPBS，25% glycerol 和 0.02% NaN3
结合能力：每 10 μL anti-Flag beads（包含悬浮液）结合 15-20 μg 含 Flag 标签的融合蛋白
配基：抗 Flag 标签（DYKDDDDK）纳米抗体（融合 6×his 标签）
反应性：结合 Flag标签的融合蛋白及与其紧密相互作用的蛋白
操作说明
收集细胞
对于一个免疫共沉淀反应，推荐使用 10 6-10 7个表达 Flag 标签融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出生长培养
基， 向培养皿中加入 2 mL 预冷的 1X PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，
细胞转移到离心管，1200 × g 离心 3-5 分钟并丢弃上清液。
裂解细胞
1. 对于细胞质蛋白，用 200 μL 预冷 Lysis buffer 重悬细胞。
注：在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和 1 mM PMSF。
对于核蛋白可选择：在 RIPA buffer 中加入 1 mg/mL DNase、2.5 mM MgCl2、蛋白酶抑制剂和 1 mM PMSF。
2. 将离心管放在冰上 30-40 分钟，每隔 10 分钟重悬细胞一次。
3. 4℃， 12000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移到一个新的预冷离心管中，加入 300 μL dilution
buffer(可用 1xPBS 代替)，弃沉淀（ 如需要，保存 50 μL 裂解液进行进一步分析）。
注：此步骤获得的细胞溶解物可置于 -80℃ 下长期保存。
可选做：在稀释液中加入 1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂。
平衡 Beads
1．混匀 anti-Flag beads，吸取 25 μL（包含 50%混悬液）放在 1.5 mL 离心管中。
2．加入提前预冷的 500 μL Dilution buffer 或 1xPBST（0.05% Tween-20）。
3．4℃，1200 × g 离心 3 分钟，去掉上清，重复 2 次。
结合蛋白
1. 将细胞裂解后获得的上清液加入平衡后的 anti-Flag beads 中，4℃上下颠倒孵育 1-3 小时。
2. 4℃， 1200 × g 离心 3 分钟，去掉上清。
洗涤
1. 加入 500 μL Dilution buffer 或 1xPBST 重悬 anti-Flag beads。
2. 4℃， 1200 × g 离心 3 分钟，去掉上清，重复 2-5 次。
可选做：在第二次洗涤的步骤中增加 NaCl浓度到 500 mM。
检测
1. 30 μL loading buffer 重悬 anti-Flag beads。
2. 将 anti-Flag beads 在 95°C 水浴中加热 10 分钟，使免疫沉淀复合物和 anti-Flag beads 分离。
3. 4°C，1200 × g 离心 3 分钟， 取上清样品通过 SDS-PAGE 或 western blot 检测。
选做步骤：洗脱（需跳过上述检测步骤）
1. 加 50 μL 200 mM glycine pH 2.5，重悬 anti-Flag beads，保持混匀状态孵育 3-10 分钟。
2. 4°C， 1200 × g 离心 3 分钟后，将上清液转移至新的离心管中，加入 25 μL 1M Tris-HCl， pH 10.4 中
和 glycine。
3. 为了提高洗脱效率可重复上述步骤 1 和 2 以增加洗脱效率。
声明：本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序等。
