产品规格
货号:KTSM1338
规格:500 μL(50% anti-Flag tag nanobody conjugated Magarose beads)
储存条件:4℃(避免冻存)
保质期:12 个月
运输:冰袋运输
产品说明
Anti-Flag Nanobody Magarose Beads ( 以 下 称 anti-Flag beads ) 是 将 抗 Flag 标 签
(DYKDDDDK)纳米抗体共价偶联到磁性琼脂糖珠上,用于抓取哺乳动物、植物、细菌、
酵母、昆虫等多种生物的细胞提取物中的含 Flag标签的蛋白及与其紧密相互作用的蛋白。
产品应用
应用于:免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(CoIP)、染色质免疫沉淀(CHIP)、RNA 结合蛋白免疫
沉淀(RIP)、酶活性检测、质谱分析(MS)等。
产品属性
珠子直径:30-100 μm(磁性琼脂糖微球)
储存液:1xPBS,25% glycerol 和 0.02% NaN3
结合能力:每 10 μL anti-Flag beads(包含悬浮液)结合 15-20 μg 含 Flag 标签的融合蛋白
配基:抗 Flag 标签(DYKDDDDK)纳米抗体(融合 6×his 标签)
反应性:结合 Flag标签的融合蛋白及与其紧密相互作用的蛋白
操作说明
收集细胞
对于一个免疫共沉淀反应,推荐使用 10 6-10 7个表达 Flag 标签融合蛋白的哺乳动物细胞。吸出生长培养
基, 向培养皿中加入 2 mL 预冷的 1x PBS 洗涤细胞 2 次,利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞,
细胞转移到离心管,1200 × g 离心 3-5 分钟并丢弃上清液。
裂解细胞
1. 对于细胞质蛋白,用 200 μL 预冷 Lysis buffer 重悬细胞。
注:在 Lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂和 1 mM PMSF。
对于核蛋白可选择:在 RIPA buffer 中加入 1 mg/mL DNase、2.5 mM MgCl2、蛋白酶抑制剂和 1 mM PMSF。
2.
将离心管放在冰上 30-40 分钟,每隔 10 分钟重悬细胞一次。
3. 4℃, 12000 × g 离心 10 分钟,将上清液转移到一个新的预冷离心管中加入 300 μL dilution buffer (可
用 1x PBS 代替),弃沉淀( 如需要,保存 50 μL 裂解液进行进一步分析)。
注:此步骤获得的细胞溶解物可置于 -80℃ 下长期保存。
可选做:在稀释液中加入 1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂。
平衡 Beads
1.混匀 anti-Flag beads,吸取 25 μL(包含 50%混悬液)放在 1.5 mL 离心管中。
2.加入提前预冷的 500 μL Dilution buffer 或 1xPBST(0.05% Tween-20),上下颠倒混匀。
3.放入磁力架静置分离磁珠 60 秒,直到上清液澄清,弃上清液,重复 3 次。
结合蛋白
1. 将细胞裂解后获得的上清液加入平衡后的 anti-Flag beads 中,4℃上下颠倒孵育 1-3 小时。
2. 用磁力架静置分离磁珠,直到上清液澄清,丢弃上清液(如果需要,保存 50 μL 上清液以供进一步分
析)。
洗涤
1. 加入 500 μL Dilution buffer 或 1xPBST 重悬 anti-Flag beads。
2. 磁力架静置分离磁珠,弃上清液,重复此步骤 2-5 次。
可选做:在第二次洗涤的步骤中增加 NaCl浓度到 500 mM。
检测
1. 30 μL loading buffer 重悬 anti-Flag beads。
2. 将 anti-Flag beads 在 95°C 水浴中加热 10 分钟,使免疫沉淀复合物和 anti-Flag beads 分离。
3. 用磁力架静置分离磁珠,取上清样品通过 SDS-PAGE 或 western blot 检测。
选做步骤:洗脱(需跳过上述检测步骤)
1. 加 50 μL 200 mM glycine pH 2.5,重悬 anti-Flag beads,保持混匀状态孵育 3-10 分钟。
2. 用磁力架静置分离磁珠,将上清液转移至新的离心管中,加入 25 μL 1M Tris-HCl, pH 10.4 中和
glycine。
3. 为了提高洗脱效率可重复上述步骤 1 和 2 以增加洗脱效率。
声明:本产品仅供科学研究使用,不能用于人、动物的医疗或诊断程序等。